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本试剂盒是一种基于TaqMan等探针的用于一步法反转录实时荧光定量PCR，主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。由于使用的探针一般是TaqMan探针，所以本方法也常称作TaqMan探针法。

本试剂盒以提取的RNA为模版，使用qPCR引物在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量PCR，操作简单快速，最大限度地减少人为误差，有效降低污染风险，节约PCR实验的操作时间，检测通量大。

本试剂盒整合了高效的BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和优异的抗体结合型热启动ByFast Taq DNA Polymerase，并优化了缓冲体系，反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，非常适合于內源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的检测。

探针法qPCR不使用荧光染料如SYBR Green等对PCR产物进行荧光染色，而是采用了荧光基团和淬灭基团(quencher)标记的DNA探针靶向拟通过PCR检测的目标序列(设计的探针结合位点通常位于两条引物结合位点之间)。正常情况下，探针上的淬灭基团由于空间上的荧光共振能力转移(FRET)而导致荧光基团淬灭。在PCR反应扩增目标序列时，引物和探针都会退火到目标基因上，随着引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性会导致结合在目标序列上的探针从5’端开始逐渐被降解。探针的荧光基团和淬灭基团被Taq酶切开后，淬灭基团的作用消失，荧光基团就能正常地被激发光所激发而产生荧光了。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基团被释放，荧光强度与新合成的目标片段数量成正比，从而就可以实现定量检测了。探针通常是目标序列特异性的一段线性DNA，5'端标记FAM或HEX等荧光基团，3'端标记BHQ1、TAMRA或MGB等荧光淬灭基团。

• 本试剂盒的特异性好、灵敏度高
  特异性并不仅仅依赖于PCR引物，探针和目标基因发生特异性的结合和降解，才能生成荧光信号，检测灵敏度和特异性通常要显著高于使用SYBR Green等荧光染料的方法。
  
• 本试剂盒可用于多重检测
  单个反应孔中，不同基因对应不同探针，不同探针对应不同荧光标记，即可进行多重荧光定量PCR检测。经测试，在适当优化引物和探针后，本产品可同时用于2～3个基因的检测。
  
• 本试剂盒能够实现便捷高效的热启动
  ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。
  
• 本试剂盒提供了探针法荧光定量PCR成套试剂
  本产品包含了反转录酶、DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、稳定剂、Nuclease-free Water、ROX (根据不同荧光定量PCR仪进行选择)和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、探针和样品RNA即可。
  
• 本试剂盒包含ROX参考染料
  本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。Probe常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。
  

  添加ROX类型	适用PCR仪
  不需添加	Bio-Rad:CFX384,CFX96,MiniOpticon,iCycler IQ,MyiQ and iQ5; Eppendorf:Mastercycler ep realplex and realplex2 s; Qiagen/Corbett Rotor-Gene:6000; Roche LightCycler 480;Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR.
  Low ROX	ABI:7500(Fast),ViiA 7,QuantStudio 6 and 7 Flex Systems; Stratagene:Mx3000P,Mx3005P and Mx4000; Qiagen/Corbett Rotor-Gene:3000; Bio-Rad/MJ:Chromo4,Opticon 2 and Opticon.
  High ROX	ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000,7700; ABI 7300,7900HT(Fast); ABI StepOne(Plus)

• 探针的荧光标记须根据所使用的qPCR仪荧光兼容性来确定。对于需要ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪，避免使用ROX标记探针。
  
• 用于多重检测时，需要适当优化引物和探针，并使用适当的不同荧光基团标记探针，确定效果后再进行多重检测，一般建议不超过三重检测。
  
• 请注意避免RNase污染，使用RNase-free的枪头、离心管等。
  
• Probe One-Step Enzyme Mix (10X)含有高浓度甘油，粘度高，使用前将短暂离心至管底，并用移液器轻轻混匀，混匀过程中尽量避免产生气泡，然后缓慢准确吸取。
  
• 使用前需确保Probe One-Step Reaction Buffer (2X)完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。
  
• 如果扩增片段较长或者RNA结构较为复杂，可将模板RNA在65℃预处理5～10分钟，可提高反转录效率。
  
• 本反应使用qPCR的Reverse Primer作为反转录的基因特异性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一链合成的引物。
  
• 注意引物退火温度，当退火温度<60℃时，推荐使用三步法PCR扩增。
  
• 对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
  
• 经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品，反复冻融可能使产品性能下降。
  
• qPCR检测是超高灵敏度的检测，PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

• One-Step qRT-PCR反应体系的设置：
  
  • 融解并混匀One-Step qRT-PCR反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
    
  • 参考下表在室温或冰浴上设置One-Step qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20μL为例)：
    

    成分	用量	终浓度
    Probe One-Step Reaction Buffer (2X)	10μL	1×
    Probe One-Step Enzyme Mix (10X)	2μL	1×
    Forward and Reverse Primer Mix (3μM each)	2μL	300nM
    Probe	0.5μL	200nM
    Template RNA	2μL	1pg～2μg
    Without or Low/High ROX (50X)	0.4μL	1×
    RNase-Free Water	至20μL

    
    注意：
    ① 当检测样品比较多时，可根据样品数量先配制所需的相同试剂的混合液，一般多配制5～10%，然后再分装到每个反应孔中，最后再在每个反应孔中加入不同的试剂，这样可使所取的试剂体积更准确更均一，误差更小，并减少试剂损失。例如：检测的目的RNA相同，而RNA样品不同，则可以把除RNA样品外的所有试剂根据样品数量配制在一起，然后分液至每个反应孔中，最后再加入不同的模板RNA。
    ② 通常引物的终浓度为0.2～0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1～1.0μM范围内调整引物的终浓度。
    ③ 最佳的探针(probe)浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关。实际使用时请参考仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行探针浓度的调节。通常探针的浓度宜低于引物的浓度，例如引物终浓度为0.3μM，则推荐的探针终浓度为0.2μM，可在0.1～0.3μM范围内调整探针的终浓度。
    ④ 通常RNA模板的量以1pg～2μg为参考用量，一般总RNA为100ng～1μg。因不同物种的模板中含有RNA的拷贝数不同，如有必要，可对模板RNA进行梯度稀释，以确定最佳的模板RNA使用量。同时，由于qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入RNA模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响，因此建议将模板RNA适当稀释后加入反应体系中，比如每个20μL反应体系2～5μL，这样可以有效提高实验的重复性。
    ⑤ 不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。
    ⑥ 96孔板的推荐反应体系为20μL，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
    ⑦ 建议设置不加模板RNA的阴性对照组。
    
  • 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
    
  • 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
• One-Step qRT-PCR反应程序：
  50℃ 15分钟一般可以得到理想的反转录效果，但如果片段较长，也可以增加至30分钟。在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的ByFast Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：
  

  过程	温度	时间	循环数
  反转录	50℃	15～30min	1
  预变性	95℃	2min	1
  变性	95℃	15sec	40
  退火/延伸	60℃	15～30sec

  
  注1：三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，仍设置40个循环即可。
  注2：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。

• 荧光定量PCR结果不理想，出现特异性不好或扩增效率不高时，可能是由于以下原因造成：
  
  • 样品RNA发生降解。此时可以通过RNA电泳等方法确认所使用的RNA样品是否发生明显的降解，在反转录实验前的实验操作过程中需要严格注意无RNA酶的实验操作。
  • 引物设计不佳。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。也可以尝试使用有文献报道使用过的引物，或者从百奥莱博订购经过测试的qPCR引物。
  • 待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时宜更换引物。
  • PCR反应体系在室温设置时容易导致非特异性条带，但在使用热启动酶时可以有效避免室温操作导致的非特异性条带的产生。但对于一些较难扩增的产物，可以尝试在冰浴上设置PCR反应体系，以进一步减少非特异性的DNA扩增。
  • 退火温度不佳，需要优化。这种情况下宜更换引物。
  • 待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。此时宜更换引物，使待扩增片段的GC含量和长度适中。
  • 模板量太低，此时宜适当加大模板量。
  • 模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
  
  
• 反应条件优化方法：
  
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1～1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。
  • 退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。如果希望提高反应特异性，可提高退火温度，以60～64℃作为退火温度的调整范围。在引物Tm值较低而得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56～64℃作为温度设置的参考范围。
  • 延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸15～30秒。对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。